Bien que l'Amérique du Nord fût déjà connue depuis près d'un siècle par les Espagnols, les Anglais ne commencèrent à la coloniser qu'en 1584 avec l'envoi de navires vers la fameuse colonie de Roanoke, la « colonie perdue ». Cette première tentative d'installation durable ayant échoué, les Anglais renvoyèrent des navires en 1606 en Virginie, alors récemment achetée à l'Espagne où ils fondèrent le fort de Jamestown (qui fut plus tard détruit par les Amérindiens, la famine, le paludisme et les rudes hivers).
« Le chef de leur congrégation, John Robinson, approuva la suggestion de fonder une colonie outre-mer. [William] Bradford en était partisan dès le début. [...] Ils armèrent un navire, recrutèrent quelques hommes, et c'est ainsi que William et sa femme quittèrent Leyde (Hollande) en 1620 à bord du Mayflower. » — William Bradford
Le bateau quitta Londres en juillet 1620, accompagné d'un autre navire, le Speedwell, qui rebroussa chemin suite à une avarie à la coque.
Après deux escales, à Southampton le 5 août 1620 puis à Dartmouth le 12 août, le Mayflower quitta Plymouth le 16 septembre 16203 (6 septembre selon le calendrier julien en usage chez les pèlerins).
À la suite d'une halte pour se ravitailler à Terre-Neuve auprès de pêcheurs locaux, une tempête menaça le bon déroulement de l'expédition. Le mauvais temps obligea le vaisseau à aborder les rivages de l'Amérique au cap Cod (sur le site de la ville de Provincetown dans le Massachusetts), le 11 novembre 1620, et non sur les bords du fleuve Hudson, but initial du voyage.
Parmi les occupants du bateau se trouvaient trente-cinq dissidents anglais, des Pères pèlerins, très pieux, fuyant les persécutions de Jacques Ier et à la recherche d'un lieu pour pratiquer librement leur religion ; ainsi que 67 « étrangers ». La plupart des passagers venaient de milieux modestes (petits fermiers, artisans…) et adhéraient aux principes puritains.
Ces Européens furent les premiers colons à s'établir durablement en Nouvelle-Angleterre, où ils décidèrent de fonder la ville de Plymouth.
Un pacte contenant un certain nombre de lois, et régissant les principes de la future colonie (plus connu sous le nom de Mayflower Compact), fut signé à bord du navire par les passagers.
Les pèlerins du Mayflower, les « Pilgrim Fathers », sont souvent considérés comme les pères fondateurs des futurs États-Unis d'Amérique.
La toute première femme européenne à débarquer fut Mary Chilton.
La dernière survivante des passagers du Mayflower était Mary Allerton, décédée à l'âge de 83 ans le 28 novembre 1699.
